01 技術(shù)原理

DNBelab C4技術(shù)是基于負(fù)壓的液滴微流控系統(tǒng)，通過引入自主專利的液滴標(biāo)簽技術(shù)（Disc-seq:Droplet-indexed high-throughput single-cell sequencing），將帶有標(biāo)簽的捕獲磁珠與單個細(xì)胞或者細(xì)胞核包裹在液滴中，采用Droplet index的技術(shù)實(shí)現(xiàn)磁珠的超泊松分布，在液滴中完成細(xì)胞裂解和捕獲mRNA或DNA分子及用于識別來自同一液滴磁珠的標(biāo)簽序列，對cDNA和Droplet index進(jìn)行文庫構(gòu)建和測序，即可一次性獲得大量細(xì)胞的基因表達(dá)或染色質(zhì)開放區(qū)基因信息。此技術(shù)與常規(guī)液滴單細(xì)胞測序技術(shù)如Drop-seq平臺1%-3%的細(xì)胞回收率相比，回收率提高至30%-60%，顯著提高了細(xì)胞的利用率，降低了單次細(xì)胞投入量。

02 技術(shù)流程

單細(xì)胞測序的一般流程包括細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞分離、裂解、擴(kuò)增、建庫、測序、數(shù)據(jù)分析等步驟。

scRNA-seq

該技術(shù)基于便攜的負(fù)壓裝置將帶有標(biāo)簽的mRNA捕獲磁珠與單個細(xì)胞或者細(xì)胞核包裹在液滴中，采用Droplet index的技術(shù)實(shí)現(xiàn)磁珠的超泊松分布，在液滴中完成細(xì)胞裂解和捕獲mRNA分子及用于識別來自同一液滴磁珠的標(biāo)簽序列，對cDNA和Droplet index進(jìn)行文庫構(gòu)建和測序，即可一次性獲得大量細(xì)胞的基因表達(dá)信息。

圖1 基于自主標(biāo)簽技術(shù)（Disc-seq）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù) scRNA-seq 

scATAC-seq

單細(xì)胞ATAC-seq從組織或細(xì)胞富集細(xì)胞核，然后利用Tn5轉(zhuǎn)座酶對染色質(zhì)開放區(qū)進(jìn)行切割，通過DNBelab C4單細(xì)胞設(shè)備，包裹轉(zhuǎn)座后的細(xì)胞核和帶有標(biāo)簽的磁珠，在液滴內(nèi)完成染色質(zhì)開放區(qū)的富集和擴(kuò)增，后續(xù)可根據(jù)高通量測序流程制備文庫并進(jìn)行測序及生信分析，轉(zhuǎn)座后細(xì)胞核投入芯片5,000-15,000，獲取1,500-9,000細(xì)胞，雙包率 <5%。

03 建庫流程

scRNA-seq

1）逆轉(zhuǎn)錄：將生成的液滴經(jīng)過破乳后，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系完成 RNA 反轉(zhuǎn)錄。

2）二鏈合成：將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物利用二鏈合成反應(yīng)體系進(jìn)行二鏈合成。

3）PCR擴(kuò)增：對合成的cDNA按照設(shè)置PCR反應(yīng)體系及參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

4）cDNA及oligo產(chǎn)物純化：將PCR產(chǎn)物使用Cleanup Beads A完成純化，分別純化出cDNA和oligo產(chǎn)物。

5）文庫質(zhì)量檢測：取1μl cDNA及oligo產(chǎn)物使Qubit dsDNA HS Kit檢測濃度，使用Agilen DNA分析試劑盒檢測片段分布。

6）上機(jī)測序：文庫檢測合格，上機(jī)測序。

scATAC-seq

1）酶處理：將生成的液滴經(jīng)過破乳后，利用ATAC Enzyme II的反應(yīng)體系進(jìn)行酶處理，去除冗余片段。

2）PCR擴(kuò)增：對回收的DNA按照設(shè)置PCR反應(yīng)體系及參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化：將PCR產(chǎn)物使用Cleanup Beads A完成純化。

4）文庫質(zhì)量檢測：取DNA產(chǎn)物使Qubit dsDNA HS Kit檢測濃度，使用2100 High Sensitivity Chip檢測片段分布。

5）上機(jī)測序：文庫檢測合格，上機(jī)測序。

04 測序策略

使用華大自主研發(fā)的國產(chǎn)化DNBSEQ Tx系列超高通量的測序儀進(jìn)行測序。

scRNA-seq

測序讀長：30+100+10bp 測序數(shù)據(jù)量：500M reads

圖2 scRNA 測序策略示意圖 

scATAC-seq

測序讀長 20+50+50bp 測序數(shù)據(jù)量：500M reads

圖3 scATAC測序策略示意圖

05 信息分析

圖4 食蟹猴組織/器官水平的單細(xì)胞UMAP聚類結(jié)果(左)以及通過質(zhì)控的每種組織中的細(xì)胞數(shù)量(右)

圖5 食蟹猴所有 cluster 的細(xì)胞類型注釋(左)以及通過質(zhì)控的每種細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)量(右)

圖6 C4 scATAC-seq分析流程圖

C4 scATAC-seq 部分結(jié)果展示：

圖7A大鼠大腦皮層樣本scATAC-seq數(shù)據(jù)的UMAP聚類圖（共計29,023個單細(xì)胞核數(shù)據(jù)）；

圖7B不同細(xì)胞類型中marker基因及管家基因的染色質(zhì)開放區(qū)域圖（如Tmem119基因的TSS區(qū)域僅在microglia中檢測到，而在其他細(xì)胞類型中沒有）